鸡精调味料中鸡源性成分检测及风险监测

作者：庄艺协 ，张娟 ，严家俊 ，佘之蕴 /广东产品质量监督检验研究院，国家食品质量检验检测中心 ( 广东 );姚丽锋 /拱北海关技术中心     

0 引言

随着生活水平不断提高，消费者在选择调味品时越来越注重其营养、健康与安全状况，现有的味精的鲜度已不能满足人们对鲜味的追求。鸡精作为调味料行业的后起之秀发展迅速，在餐饮行业被广泛使用。鸡精是一种具有鲜味、鸡肉味的复合增鲜调味料，含有多种氨基酸与蛋白质，具有丰富的营养价值。鸡精调味料中鸡肉原料在提高产品的特征风味的同时，还可以提升产品的品质，其中鸡肉的添加量和加工工艺直接影响到产品的成本和利益。SB/T10371—2003《鸡精调味料》和SB/T10415—2007《鸡粉调味料》中均规定，以鸡肉/鸡骨的粉末或其浓缩提取物为原料加工而成的复合调味料，即明确规定了“鸡精中必须含有鸡源性成分”。标准希望通过测定鸡精中总氮及其他氮的含量来作为衡量鸡精中是否含有鸡肉的标准，但含氮量可以通过其他添加物来实现，所以并不能体现鸡肉成分的有无。基于上述问题的存在，尚无明确的针对鸡精调味料中是否存在鸡源性成分的检测方法。然而目前市场上，鸡精产品纷繁多样，质量参差不齐，甚至存在“鸡精无鸡”的问题，严重侵害消费者的利益。如何快速甄别真假鸡精调味料成为亟待解决的问题。以基因为检测对象的实时荧光PCR方法已广泛应用于物种成分鉴定，具有特异性好和灵敏度高的特点。现阶段政府风险监测任务推荐可以借鉴的检测方法为GB/T38164—2019《常见畜禽动物源性成分检测方法实时荧光PCR法》中鸡源性成分的检测，然而鸡精中的成分复杂且加工工艺繁琐，对于实时荧光PCR的干扰因子较多，能否高效地获取深加工产品中残留的DNA成为制约该检测方法成功与否的关键问题。为验证该检测方法对于鸡精调味料中鸡源性成分检测的有效性及可行性，本研究基于该检测方法检测鸡精调味料中的鸡源性成分，重点解决DNA的提取和富集问题，同时基于该检测方法对市面上的鸡精调味料中鸡源性成分真伪属性进行风险监测，以期为鸡精调味料的安全监管提供技术支持和基础数据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂

鸡精调味料：市售

十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、蛋白酶K（均为分析纯）、食品基因组提取试剂盒（Food DNA Kit）、核酸提取试剂、Premix Taq DNA聚合酶、引物。
1.2仪器与设备

QuantStudio 7 Flex荧光PCR仪；Nanodrop 2000微量紫外分光光度计；3-30K高速冷冻离心机；Thermomixer comfort恒温混匀仪。
1.3试验方法
1.3.1DNA提取方法

样品前处理：取500mg样品于适宜离心管中，加入2mL无菌水，50℃温育1h，待样品重复溶解后，12000g离心5min，弃滤液，沉淀物用于后续DNA提取。CTAB法参考GB/T38164的方法，同时需另外加入20μL20mg/mL蛋白酶K；磁珠法和硅胶柱法分别依据作业指导书进行操作。
1.3.2 DNA浓度和纯度的测定

通过微量紫外分光光度计分别检测DNA在260nm和280nm处的吸光值，通过OD260/OD280比值判断提取的DNA的纯度。该比值在1.7~2.1之间，说明DNA纯度较高。DNA浓度根据1OD260=50μg/mL双链DNA估算。
1.3.3实时荧光PCR检测

依据GB/T38164—2019《常见畜禽动物源性成分检测方法实时荧光PCR法》对鸡源性成分进行检测。反应体系：PCR反应液12.5μL，引物各0.5μL，探针0.5μL，DNA模板5μL，双蒸水6.0μL，总体积为25μL。反应条件：95℃、5min，95℃、15s，60℃、40s，40个循环。
1.3.4鸡源性成分风险监测

基于前期建立的检测方法，对从市场上抽检的30批次鸡精调味料产品进行是否含有鸡源性成分的风险监测，摸查现有鸡精调味料产品的质量情况。
1.4数据处理

结果判定依据循环数（Ct）值，原则如下：

当Ct值≤35.0，则判定被检样品为阳性；

当Ct值≥40.0，则判定被检样品为阴性；

当35.0＜Ct值＜40.0，则重复一次。如果Ct值仍＜40.0，则判定为阳性；如果Ct值≥40.0，则判定为阴性。
2 结果与分析
2.1DNA提取效率

为提高DNA的提取效率，在加大取样量的前提下，对比样品处理前后提取DNA的效果（以2个不同样品为例，分别标记为S1和S2）。经微量紫外分光光度计测定，3种DNA提取方法所获得的DNA浓度和纯度结果如表1所示，每个样品均作平行。由表1可知，3种方法在样品前处理之后，DNA浓度均有所提高，表明该前处理方法有提高鸡精DNA浓度的效果。本次对2个样品分别进行3种不同方法的DNA提取，2个样品的DNA提取浓度有较大差异，推测与鸡精的不同生产工艺有较大关系；S2样品的生产工艺相对S1样品对DNA的破坏较为严重，从检测结果来看，尚不能满足后续荧光PCR检测需求。对比样品处理后3种提取方法的提取效果，S1样品中硅胶柱法的提取效果最好，在DNA浓度差异不大的情况下，DNA纯度在1.7~2.1的范围内，表明该方法去除杂质效果最好；磁珠法提取的DNA纯度去除杂质效果也较好，在1.68~1.78范围内；CTAB法提取的DNA浓度虽然相比其他2种方法较高，但DNA纯度较低（1.28~1.33），去杂质效果较弱。S2样品中3种方法的DNA提取浓度虽然不高，但硅胶柱法和磁珠法的DNA纯度较好，基本符合要求。综合上述结果分析，硅胶柱法和磁珠法提取纯度和效率优于CTAB法，更适合用于鸡精的DNA提取，与这2种方法分别具有纯化过程和特异性富集过程有较大关系。提取纯度决定后续荧光PCR的扩增效果和灵敏度，提取效率决定后续检测方法的便利性。
2.2 实时荧光PCR检测

鸡精调味料S1和S2基因组DNA的实时荧光PCR检测结果见图1~图4。从图1和图3可以看出，3种提取方法获得的2个鸡精调味料样品的基因组DNA均能扩增出内参基因（18SrRNA基因），循环数（Ct）值介于19~23之间，呈现典型的“S”形曲线，其中S1的荧光强度明显高于S2的荧光强度，与2个样品的起始浓度相对应。如图2所示，3种提取方法获得S1的基因组DNA均能扩增出鸡特异性基因ND1，Ct值介于20~25之间，呈现典型的“S”形曲线，其中硅胶柱法和磁珠法的荧光强度明显高于CTAB法的荧光强度，且Ct值小于后者，与2.1中3种方法DNA的提取效率相对应。鸡精调味料S2样品因基因组DNA提取效果一般（见表1），导致其荧光PCR扩增结果荧光信号相对阳性对照较弱（见图4），其中CTAB法提取的DNA未出现有效扩增。硅胶柱法和磁珠法的Ct值分别为23和29，相对S1样品的扩增Ct值偏大。综上所述，对比DNA提取效率和荧光PCR扩增结果分析，硅胶柱法和磁珠法更加适合于鸡精调味料的DNA提取和扩增，在S2样品DNA提取效果不佳的情况下（考虑该结果由生产工艺造成），上述2种提取方法获得的DNA仍能进行有效扩增，满足后续鸡源性成分结果判定的要求。硅胶柱法相比磁珠法，DNA提取效率和荧光PCR扩增结果均优于后者，考虑到DNA提取过程的繁琐程度，在实际操作中可先用磁珠法（全自动提取）进行快速提取检测，当检测结果难以进行判定时，再用硅胶柱法进行下一步的确认，在不影响试验结果准确性的前提下，有效提高检测工作效率。
2.3鸡精调味料风险监测结果

基于上述的DNA提取和扩增结果比较，风险监测采用硅胶柱法和磁珠法同时进行鸡精调味料产品的DNA提取，并对比2种提取方法的荧光PCR结果进行最终结果的判定。结果表明，2种提取方法获得较为一致的扩增结果，其中磁珠法极大地缩短了检测时间且人工依赖程度低，有效提高了检测效率。本次监测鸡精调味料类产品共计30批次，检出鸡源性成分的产品有28批次，未检出鸡源性成分的产品有2批次，问题发现率为6.67%。其中未检出鸡源性成分的产品标签标识含有鸡油，检出鸡源性成分的产品标签标识含有鸡肉、鸡肉粉、鸡肉蛋白粉及鸡膏等（见表2）。不同类型的鸡精调味料产品虽然因生产工艺的不同对DNA造成不同程度的破坏，加之配方的不同增加了提取DNA的干扰成分，造成荧光PCR扩增结果的很多不确定性，但风险监测结果表明，针对该类特殊产品，现有的监测方法可有效地提取鸡精调味料中DNA，荧光PCR扩增效果可满足日常风险监测的需求。
3 结论

食品及其加工产品基因组DNA的提取效果是影响后续分子生物学检测的重要因素之一。鸡精调味料是利用肉鸡加工中的副产品进行深加工，采用高温高压等烹饪工艺，DNA分子易受到破坏[28]。从DNA提取效率和荧光PCR的扩增结果来看，不同产品类型DNA破坏程度有所不同，但均能获取可满足结果判定的DNA，其中硅胶柱法和磁珠法提取效果优于CTAB法，考虑到便利性的前提下，优先推荐磁珠法提取鸡精调味料产品的DNA。但当遇到鸡精调味料产品的DNA提取效果不佳时，建议结合磁珠法进一步确认结果，以防误判。

本研究对鸡精调味料中的鸡源性成分检测进行方法验证和优化，可满足该类产品中鸡源性成分的检测，解决了标准中有关鸡肉成分是否存在的问题，对打击假冒伪劣鸡精调味料产品提供技术支撑。因真正的鸡精调味料势必会比仅添加香精的产品成本高，而目前现行的检测标准并未对鸡精调味料中鸡源性成分检测做出相应规定，势必会造成某些商家为了节约成本而欺骗消费者。国内关于鸡精调味料中鸡源性成分的风险监测研究较少，现有研究证实确实存在假冒伪劣产品，本研究为后续该类产品的质量监管提供可行的风险监测方案。